Cara mendakan DNA isopropanol: prinsip dan aplikasi

Dalam eksperimen biologi molekul, pengekstrakan dan pemurnian DNA adalah langkah penting. Untuk mengekstrak DNA tulen dari sel atau tisu, reagen kimia dan kaedah operasi yang berbeza sering diperlukan. Kaedah pemendapan isopropanol adalah teknik pemendakan DNA yang biasa dan berkesan yang digunakan secara meluas dalam pelbagai eksperimen biologi. Bagaimana isopropanol mendakan DNA? Artikel ini akan memperkenalkan prinsip, langkah operasi dan aplikasinya secara terperinci.

Prinsip DNA pemendakan isopropanol

DNA terdiri daripada rantaian panjang molekul asid deoksiribonukleik yang biasanya larut dalam larutan air atau garam. Apabila isopropanol ditambahkan, kekutuban dalam larutan berubah secara drastik. Sifat tidak polar isopropanol menjadikan molekul DNA secara beransur-ansur kehilangan penghidratan, yang menyebabkan kelarutan DNA dalam larutan berkurang. Pada masa ini, molekul DNA akan berkumpul dan menetap.

Isopropanol memainkan dua peranan penting dalam proses pemendakan DNA:

1. Kesan depolarisasi: Penambahan isopropanol mengurangkan kekutuban air, sehingga molekul DNA tidak dapat disimpan dalam larutan, sehingga mendorong pengendapan.
2. Bantuan ion garam: Semasa mengekstrak DNA, garam (seperti natrium klorida atau ammonium klorida) biasanya ditambahkan. Peranan garam adalah untuk meneutralkan cas negatif pada molekul DNA, mengurangkan penolakan elektrostatik antara molekul, dan menjadikan DNA lebih mudah terkumpul dan mengendap.

Langkah-langkah: Cara Memendakan DNA dengan Isopropanol

Langkah eksperimen untuk mendakan DNA menggunakan isopropanol agak mudah, tetapi keadaan penyelesaian perlu dikawal dengan tepat. Berikut adalah proses operasi standard:

1. Penyediaan penyelesaian DNA: Pertama, ekstrak DNA dari sel atau tisu, biasanya gunakan larutan lisis (seperti Tris, EDTA, NaCl, dll.) Untuk memusnahkan membran sel dan melepaskan DNA. Kemudian, serpihan sel dikeluarkan melalui sentrifugasi untuk mendapatkan cecair yang berlebihan.
2. Masukkan larutan garam: Untuk meningkatkan kesan pemendakan DNA, tambahkan jumlah larutan garam yang sesuai ke cecair pembersih atas. Garam yang biasa digunakan adalah natrium klorida (NaCl) atau ammonium klorida (NH4Cl), yang dapat membantu molekul DNA meneutralkan cas negatif dan meningkatkan kecekapan pemendakan DNA.
3. Tambah isopropanol: Tambahkan isopropanol yang sama atau hampir dengan isipadu larutan ke larutan DNA, dan gaul rata dengan lembut. Pada ketika ini, molekul DNA akan mula menetap.
4. Pengumpulan sentrifugal pemendakan DNA: Masukkan larutan campuran ke dalam sentrifugal, dengan sentrifugal berkelajuan rendah, biasanya 8000-12000 rpm, dan sentrifugal sekitar 10-15 minit. Pada masa ini, pemendakan DNA akan muncul di bahagian bawah tiub empar.
5. Pembersihan dan pembubaran: Keluarkan cecair pembersih dengan berhati-hati, bersihkan pemendakan DNA dengan 70% etanol untuk menghilangkan sisa garam dan kekotoran lain. Akhirnya, pemendakan dibubarkan dalam larutan yang sesuai (seperti penampan TE atau air) untuk analisis seterusnya.

Kelebihan dan batasan DNA pemendakan isopropanol

Kelebihan

1. Mudah dan senang: Kaedah pemendapan isopropanol mudah dikendalikan dan tidak memerlukan peralatan yang rumit.
2. Kecekapan tinggi: Dengan syarat kepekatan garam yang sesuai, isopropanol dapat memendapkan DNA dengan berkesan, dengan kemurnian tinggi, dan sesuai untuk kebanyakan eksperimen pengekstrakan DNA.
3. Kos rendah: Berbanding dengan kaedah pemurnian DNA yang lain, kos penggunaan isopropanol lebih rendah dan sesuai untuk makmal kecil dan sederhana.

Batasan

1. Boleh menyebabkan pencemaran: Sekiranya eksperimen tidak dikendalikan dengan betul, ia boleh menyebabkan penurunan DNA atau membawa kekotoran lain.
2. Tidak sesuai untuk semua sampel: DNA dalam beberapa sampel khas mungkin sukar dipulihkan kerana pemendakan berlebihan, atau kerana sampel mengandungi bahan tidak larut lain, kesan pemendakan kurang baik.

Masalah biasa dalam eksperimen: penyebab kegagalan pemendakan DNA isopropanol

Walaupun kaedah pemendapan isopropanol sangat biasa dalam pengekstrakan DNA, terdapat juga kemungkinan kegagalan pemendakan. Sebab-sebab biasa termasuk:

1. Kepekatan garam tidak sesuai: Kepekatan garam yang terlalu rendah boleh menyebabkan pemendakan molekul DNA yang tidak lengkap; kepekatan garam yang terlalu tinggi boleh menyebabkan pemendakan DNA yang tidak lengkap dan mengandungi terlalu banyak garam.
2. Nisbah isopropanol yang salah: Nisbah isipadu isopropanol dengan larutan tidak betul, yang boleh mempengaruhi kesan pemendakan DNA. Secara amnya, isipadu isopropanol harus 1 kali ganda daripada jumlah larutan DNA.
3. Kelajuan sentrifugal tidak mencukupi: Kelajuan sentrifugal terlalu rendah atau waktunya terlalu pendek, yang boleh menyebabkan DNA tidak mengendap sepenuhnya. Adalah perlu untuk memastikan bahawa keadaan sentrifugal cukup ketat untuk memastikan bahawa DNA dikitar semula dengan berkesan.

Ringkasan

Pengekstrakan DNA melalui pemendapan isopropanol adalah kaedah yang mudah dan cekap. Memahami prinsip bagaimana isopropanol mendakan DNA, menguasai langkah operasi yang betul, dan mengatasi masalah eksperimen yang mungkin dapat membantu penyelidik mengekstrak dan membersihkan DNA dengan lebih baik. Walaupun kaedah ini digunakan secara meluas dalam banyak eksperimen, ia juga perlu menyesuaikan perincian operasi mengikut keperluan eksperimen tertentu untuk mendapatkan sampel DNA berkualiti tinggi.